VEEHÜGIEEN

Joogivee analüüs membraanfiltratsiooni meetodil

 

Les Endo agar (punane):

+35 ºC, 24 h

metalne sära

oksüdaas neg. (Coli-laadsed)

laktoos pos. (Coli-laadsed)

indool pos. (E. coli)

 

Tergitol agar (roheline):

+35 ºC, 24 h

kollane koloonia (Coli-laadsed)

oksüdaas neg. (Coli-laadsed)

laktoos pos. (Coli-laadsed)

indool pos. (E. coli)

 

Foto autor: prof. Ari Hörman, 2006

 

Membraanfiltri meetod seisneb uuritava veeproovi mõõdetud koguse filtreerimises läbi membraanfiltri, mille poori läbimõõt on kuni 0,45 μm. Filter peab kinni bakterid, kuid võimaldab veeproovil pääseda läbi filtri. Membraanfilter koos bakteritega asetatakse kasvama Petri tassile, milles on sobiv selektiivsööde. Söötme valik sõltub sellest, milliste bakterite arvukust soovitakse määrata. ISO standard 9308-1:2000, mis on aluseks ka Eesti joogivee mikrobioloogilise kvaliteedi hindamisel Coli-laadsete bakterite määramiseks, näeb ette laktoos TTC tergitooliga agarsöötme kasutamise, 21 ± 3 tundi inkubeerimise temperatuuril 36 ± 2 ºC.

 

Töö sooritatakse kahel järjestikusel laboril – esimesel korral filtreeritakse uuritav vesi läbi membraanfiltri, mis seejärel asetatakse Petri tassil olevale selektiivsele agarsöötmele (nt. Tergitol-7 agar. Petri tassid inkubeeritakse. Teisel päeval toimuval labortööl tehakse selektiivsel söötmel väljakasvanud kolooniate kvantitatiivne analüüs.

 

Sissejuhatus:

Coli-laadsed bakterid on gramnegatiivsed, endospoore mitte moodustavad, lühikesed pulgakujulised bakterid.

 

Coli-laadsete bakterite defineerimisel ei ole aluseks võetud taksonoomilised kriteeriumid, vaid nimetatud bakterite rühma määramisel kasutatavad söötmed ja inkubeerimistingimused.

 

Terminiga Coli-laadsed tähistatakse bakterite rühma, kes inkubeerimisel 48 tunni jooksul temperatuuril 36 ± 2 ºC kääritavad laktoosi, tootes hapet ja gaasi. Nad kõik sisaldavad ensüümi ß-galaktosidaas ja on gram-negatiivsed, oksüdaasnegatiivsed, aeroobid või fakultatiivsed anaeroobid, paljud neist on liikuvad, endospoore mittemoodustavad pulgakujulised bakterid, peamiselt perekondade Escherichia, Enterobacter, Klebsiella ja Citrobacter esindajad. Kuna nimetatud bakterid on looduses laialdaselt levinud, ei ole coli‑laadsete bakterite grupp seega spetsiifiline fekaalse saastatuse näitaja.

 

 

Töö käik: vastavalt standardile EVS-EN ISO 9308-1:2002. Vee kvaliteet. Coli-laadsete, termotolerantsete coli-laadsete mikroorganismide ja eeldatavalt Escherichia coli avastamine ja loendamine. Osa 1: Membraanfiltratsiooni meetod

 

Esimene labor:

 

  1. Markeeri kasutusele tulev Petri tass, millel on juba tardunud Tergitol-7 agarsööde.

 

  1. Steriliseeri etanooliga filtreerimisseade mahuti seestpoolt ning samuti filtri alus.

 

  1. Vabasta steriilne membraanfilter paberist ja kasutades steriilseid pintsette aseta filter filteralusele.

 

  1. Aseta mahuti tagasi.

 

  1. Enne kui alustad uuritava veeproovi filtreerimisega, vala mebraanfiltri mahutisse umbes 10 ml steriilset vett.

 

  1. Pane tööle vaakumpump ning jälgi, et filtreerimise kiirus oleks õige.

 

 

  1. Proovi segamiseks loksuta uuritavat veeproovi.

 

  1. Pane vaakumpump kinni ning vala kindel kogus (tavaliselt 100 ml) uuritavat veeproovi filterseadme mahutisse. Pane vaakumpump tööle ning filtreeri veeproov läbi membraanfiltri.

 

  1. Kui kogu proov on läbinud filterseadme, vala mahutisse steriilne vesi, mille hulk on võrdne filtreeritava veeproovi hulgaga (100 ml). Vala loputusvesi mööda mahuti seinu, et kaasa haarata mikroobe, mis võisid eelnevalt mahuti seinale jääda.

 

  1. Filtreeri kogu loputusvesi läbi filtri. Kui vesi on filtri läbinud, jäta vaakumpump tööle umbes 1 minutiks või niikauaks, kui filter näib kuiv.

 

  1. Lülita vaakumpump välja.

 

  1. Eemalda filterseadme mahuti.

 

  1. Võta steriilsete pintsettidega ettevaatlikult mebraanfiltri servast ja aseta see eelnevalt markeeritud Tergitol-7 agarsöötmega Petri tassile. Tee seda nii, et membraanfiltri ja söötme pinna vahele ei jääks õhumullikesi.

 

  1. Inkubeeri plaate temperatuuri 36 ± 2 ºC juures 21 ± 3 tundi

 

 

Teine labor:

 

  1. Vaatle Petri tassil väljakasvanud kolooniaid. Märgi ära ja loenda laktoospositiivsete bakteritena üles kõik kolooniad (sõltumata suurusest), mis värvuvad kollaselt. Mõnikord võib koloonia olla keskelt rooste värvi. Kollase värvuse olemasolu peab olema täheldatav ka plaadi põhjalt vaadates.

 

  1. Oksüdaas- ja indooltesti teostamiseks kultiveeri eelistatavalt kõik või vähemalt kümme iseloomulikku kolooniat mitteselekteerivale agarile (trüptoon-soja agar, TSA).

 

  1. Inkubeeri mitteselekteeriva agari plaate temperatuuri 36 ± 2 °C juures 21 ± 2 tundi ning seejärel teosta oksüdaastest.

 

  1. Mitteselekteerivalt agarilt kanna uuritava tüve baktermassi trüptoon puljongisse (3 ml) ning inkubeeri puljongit temperatuuri 44 ± 0,5 °C juures 21 ± 3 tundi ja seejärel teosta indooltest.

 

 

  1. Indooltesti teostamisel pipeteeri 0,2 - 0,3 ml Kovac´i reagenti bakterite kasvuga trüptoon puljongi tuubi. Kirsi punase värvuse teke puljongi pinnale viitab positiivsele reaktsioonile.

 

  1. Määra 100 ml uuritava vee proovis olevate E. coli ja coli-laadsete bakterite arv.

 

 

Loenda coli-laadseteks bakteriteks kõik kolooniad, mis andsid negatiivse oksüdaasreaktsiooni.

 

Loenda E. coli–na kõik kolooniad, mis andsid negatiivse oksüdaas- ja positiivse indoolreaktsiooni

 

Määra 100 ml uuritava vee proovis olevate E. coli ja coli-laadsete bakterite arv.

 

Kolooniate hindamine vastavalt söötme juhendile (Tergitol-7 agarsööde):

Escherichia coli: kollased kolooniad, mille ümber on kollane tsoon. Mõnikord võib koloonia olla keskelt roostevärvi.

Enterobacter/Klebsiella species: Rohekas kollased kolooniad.

Salmonella liigid: Sinaka tsooniga punased kolooniad.

Shigella liigid: Sinaka tsooniga punased kolooniad.

Proteus liigid: Sinaka tsooniga punased kolooniad.

Pseudomonas species: Sinaka tsooniga punased kolooniad.

Gram-positiivsed bakterid: kasv on väga väike või puudub.

 

Ühisveevärgi joogiveele esitatavad mikrobioloogilised kvaliteedinõuded vastavalt sotsiaalministri 31. juuli 2001. a. määrusele nr. 82 "Joogivee kvaliteedi- ja kontrollinõuded ning analüüsimeetodid"

E. coli: 0 cfu/100 ml



<< tagasi / edasi >>